HPLC在全行业运用越来越广泛，因此每一个实验室分析人员都应该熟练掌握并应用HPLC，对于一些常见的故障分析应该做到游刃有余，才能在运行故障的时候即使解决问题，提高工作效率。
本文主要介绍高效液相色谱仪HPLC30个常见问题的对策。
1、保留时间发生漂移或快速变化的原因
关于漂移问题：
①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定；
②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等；
③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。
关于快速变化问题：
①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定；
②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出；
③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合。
2、出现拖尾或双峰的原因
①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子；
②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子；改换流动相或更换选择性好的柱子；
③可能柱超载，减少进样量。
3、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
①样品量不足，
解决办法为增加样品量；
②样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子；
③样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器；
④检测器衰减太多。调整衰减即可；
⑤检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数；
⑥检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗；
⑦检测池中有气泡。解决办法为排气；
⑧记录仪测压范围不当。调整电压范围即可；
⑨流动相流量不合适。调整流速即可；
⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
4、做HPLC分析时，柱压不稳定
①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
②比例阀失效，更换比例阀即可；
③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
⑤系统检漏，找出漏点，密封即可；
⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
5、更换了另一种牌号ODS柱，但保留时间不能重现？
这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如，三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。
6、HPLC柱验收测试时柱压过高
柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
①拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
②把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
③将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。
④更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne7315型，过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
7、色谱柱中的流动相会排干吗
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为，泵只能输送液体，而不能输送空气。
相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如，经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
8、基线漂移原因、解决方法
1)原因分析
①柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）
②流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
③流通池被污染或有气体
④检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
⑤流动相配比不当或流速变化
⑥柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
⑦流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
⑧样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰
样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
⑨使用循环溶剂，不提倡。未调整检测器。
⑩检测器没有设定在最大吸收波长处。
2)解决方法
①控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器
②使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用在线脱气或氦气脱气。
③用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
④取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
⑤更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
⑥用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。使用离子对试剂、缓冲盐更应注意平衡柱。
⑦检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂⑧改变分析条件。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
⑨重新设定基线。使用新的流动相。
⑩将波长调整至最大吸收波长处。重选检测波长。
9、规则的基线噪音产生的原因
①在流动相、检测器或泵中有空气（尖锐峰）
②漏液。
③流动相混合不完全。
④温度影响（柱温过高，检测器未加热）
⑤在同一条线上有其他电子设备（偶然噪声）
⑥泵振动。
解决方法 ：
①流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
②检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
③用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
④减少差异或加上热交换器
⑤断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。采用精密级稳压电源。
⑥在系统中加入脉冲阻尼器。
本文针对HPLC使用常见故障进行了较全面的分析，如，输液泵中的单向阀、泵垫圈、色谱柱、检测器的常见故障，并结合日常工作实际，提出了一些可参考的做法和解决对策。以便使用者能及时注意所述问题，做到有问题及时解决，这样既能大大延长仪器的使用寿命,又能使仪器的性能得到最大限度的发挥。
10、不规则的基线噪音产生原因
①漏液。
②流动相污染、变质或由低质溶剂配成。
③流动相各溶剂不相溶。
④检测器/记录仪电子元件的问题。
⑤系统内有气泡。
⑥检测器内有气泡。
⑦流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）
⑧检测器灯能量不足。
⑨色谱柱填料流失或阻塞。
⑩流动相混合不均匀或混合器工作不正常。
以上相应解决方法：
①检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。
②检查流动相的组成。
③选择互溶的流动相。
④断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
⑤用强极性溶液清洗系统。
⑥清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器。
⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池。
⑧更换灯。
⑨更换色谱柱。
⑩维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。
11、保留时间漂移的故障排除
保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。
保留时间漂移的几种最常见的原因如下：
1)色谱柱平衡
如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。 流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。
2)固定相稳定性
固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。 经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。
3)色谱柱污染
保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。
样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。
4)流动相组成
流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。
5)疏水坍塌
当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如，Waters Symmetry Shield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如，Waters Resolve色谱柱）也可避免发生坍塌。
12、为何出现肩峰或分叉
①样品体积过大－－用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% ；
②样品溶剂过强－－采用较弱的样品溶剂；
③柱塌陷或形成短路通道－－更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件；
④柱内烧结不锈钢失效－－更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品；
⑤进样器损坏－－更换进样器转子。
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