一、应用背景
甲基硫菌灵(又名甲基托布津)是一种广范谱内吸型杀菌剂,被广泛用于防治果品的轮纹病和黑腐病及贮藏期的青霉病和绿霉病等。但因生产商和销售环节的违规操作,使果品中甲基硫菌灵的含量超过国家标准(GB14870-94)规定（最高留限量每千克不超过0·5mg）。
为防止高残留农药的果品及加工品上市,国家要求销售前按国标SN0162-92用气相色谱—质谱仪法,测定甲基硫菌灵的含量。但该方法仪器昂贵,操作技术复杂。为此介绍一种简便易行、准确可靠、一般实验室即可测试的紫外分光光度计测定法。
二、应用仪器
紫外分光光度计，电子分析天平，离心机，烧杯，吸管，容量瓶，吸水纸，ph试纸
三、应用试剂及配制
精确称取50mg甲基硫菌灵可湿性粉剂,放入烧杯中,用三氯甲烷溶解,定容至50ml。从中准确吸取10·00ml甲基硫菌灵的标准液,移入100ml容量瓶中,用三氯甲烷稀释至刻度,制成甲基硫菌灵标准使用液。同样精确称取50mg多菌灵放入50ml容量瓶中,用1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度。再准确吸取10·00ml多菌灵标准储备液,移入100ml容器瓶中,用1mol/L盐酸溶液定容至刻度,制成多菌灵标准使用液。
四、待测样品的提取和分离
随机抽取果实样品,用清水洗去泥沙,晾干或用吸水纸吸干果实表面的水。将果实纵切分成两等份,取果肉部分,置于干燥的组织捣碎机或研钵内破碎磨细。称取50g果泥样品,加50ml甲醇,用高速离心机(每分钟6000转)离心分离10分钟,移上清液于烧杯中。沉淀物用20ml甲醇搅匀后,加水10m,l作用10分钟,再次高速离心10分钟。上清液并入盛滤液的烧杯中,在80℃水浴上用热空气流吹去部分甲醇,倒入分液漏斗中,加10%的氯化钠溶液30ml和25ml石油醚,混合摇动2分钟后,再加25ml石油醚振摇2分钟以充分提取待测物药液。除去石油醚,加盐酸提高酸度至pH值1~2,用二氯甲烷提取两次(每次加25m,l作用2分钟)。合并两次的提取液,用25ml蒸馏水洗涤1次,用尖嘴吸管吸出二氯甲烷层,移入干燥的分液漏斗中,供甲基硫菌灵含量测定之用。水洗液合并入水层,留作多菌灵测定用。
五、绘制标准曲线
准确吸取0·0、0·1、0·3、0·5ml甲基硫菌灵标准使用液(相当于0、10、30、50μg甲基硫菌灵),分别置于30ml圆底离心器中,离心挥干溶剂后,各加入10ml乙酸-乙酸铜溶液及2~5粒玻璃珠,接上空气冷凝器,于酒精灯或微型电炉上缓缓加热煮沸30分钟取下,用20ml浓度为1mol/L的盐酸洗涤冷凝管和圆底离心管,作用2分钟。将液体移入125ml分液漏斗中。用二氯甲烷提取2次,每次用量10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷层移入备用的干燥分液漏斗中。上述酸溶液用2mol/L的氢氧化钠中和,调整pH值至6·0~6·5(碱液用量为25ml),中和液用二氯甲烷提取2次,每次20m,l把两次的提取液合并在一起,再用10ml蒸馏水洗涤分液漏斗,静置分层后,将二氯甲烷层并入另一存有二氯甲烷层的分液漏斗中。准确加入10ml浓度为1mol/L盐酸,再次提取5分钟,静置10分钟左右。待分层后,将酸提取液倒入1cm石英双色杯中,用1mol/L的盐酸调节分光光度计的零点,在波长282nm处分别测0~50μg甲基硫菌灵标准液的吸光度(A282)。以A282值为纵坐标,甲基硫菌灵的含量为横坐标,绘制甲基硫菌灵的标准曲线。准确吸取0·0、0·1、0·3、0·5ml多菌灵标准使用液(相当于0、10、30、50μg多菌灵),放入分液漏斗各加入20ml浓度为1mol/L的盐酸,用二氯甲烷提取2次,每次用10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷层,移入干燥的分液漏斗中。酸液用2mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH值6·0~6·5,用二氯甲烷提取2次,每次20m,l提取液用10ml蒸馏水洗涤1次。静置分层后,将两次的二氯甲烷层合并,准确加入10ml浓度为1mol/L的盐酸,再次酸提5分钟。静置10分钟。待分层后,将酸提液倒入1cm石英双色杯中,用1mol/L的盐酸调节分光光度计的零点。在波长282nm处分别测0~50μg多菌灵标准液的吸光度值(A282)。以A282值为纵坐标,多菌灵的含量为横坐标,绘制多菌灵的标准曲线。
六、测定果品中的甲基硫菌灵和多菌灵含量
取果肉的二氯甲烷提取液,自然挥干或加热挥干后,用10ml乙酸-乙酸铜溶液分次溶解残渣,并移入30ml圆底离心器中,加2~5粒玻璃珠,接上空气冷凝管,用酒精灯或微型电炉缓缓煮沸30分钟取下,用20ml浓度为1mol/L的盐酸从冷凝管顶端洗涤冷凝管和圆底离心管,作用2分钟。将液体移入125ml分液漏斗中,用二氯甲烷提取2次,每次用量10ml。用尖嘴吸管吸出二氯甲烷层移入备用的干燥分液漏斗中。上述酸溶液用2mol/L的氢氧化钠中和,调整pH值6·0~6·5(碱液用量为25ml)。中和液用二氯甲烷提取2次,每次20m,l把两次的提取液合并在一起,再用10ml蒸馏水洗涤分液漏斗,静置分层后,将二氯甲烷层并入另一种存有二氯甲烷层的分液漏斗中,准确加入10ml浓度为1mol/L的盐酸,再次提取5分钟,静置10分钟左右。待分层后,将酸提取液倒入1cm石英双色杯中,用1mol/L的盐酸调节分光光度计零点。在波长282nm处测样品的吸光度。与甲基硫菌灵的标准曲线比较,计算样品中甲基硫菌灵的含量。取“待测样品的提取和分离”中的多菌灵测定液,用2mol/L氢氧化铵溶液中和至pH值6·0~6·5,用二氯甲烷提取2次,每次20m,l提取液用10ml蒸馏水洗涤1次,静置分层后,将两次的二氯甲烷层合并,准确加入10ml浓度为1mol/L盐酸,再次酸提5分钟。静置10分钟,待分层后,将酸提液倒入1cm石英双色杯中,用1mol/L的盐酸调节分光光度计零点。在波长282nm处测定样品的吸光度。与多菌灵的标准曲线比较,计算样品中多菌灵的含量。
测定结果按下式计算:X=V1×Cm×V2×100，式中V1为加入提取溶剂的总毫升数;m为样品重量(g);V2为测定时使用提取溶剂的毫升数;C为相当于标准浓度(mg);X为样品中甲基硫菌灵的含量(mg/kg)。
(注意:用石油醚和二氯甲烷萃取的整个过程,不论加入量还是取出量,必须准确、快速。当甲基硫菌灵残留量过高时,可减少样品的用量或增加稀释倍数。)
