本方法适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的检验。

一、方法原理    

试样中残留的孔雀石绿经乙腈-乙酸盐酸缓冲混合液提取后，经乙腈再次提取，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱—二氧化铅柱后衍生测定，外标法定量。

二、主要仪器设备            

1. 上海仪电分析高效液相色谱仪LC210，带紫外检测器

2.电子天平FA2004

3.超声波水浴

4.电热恒温水浴锅

5.匀浆机

6.离心机：4 000 r/min。 

7.固相萃取装置 

8.25% PbO2氧化柱：临用前用甲醇冲洗，并将PbO2氧化柱连接在紫外-可见检测器

液相色谱柱之间  

9.酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5 mL乙腈活化

三、试剂

1.乙腈：色谱纯

2. 二氯甲烷：分析纯 

3. 甲醇：色谱纯

4. 乙酸盐缓冲液：准确称取4.95g 无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸，溶解于950mL水中，用冰乙酸调节溶液pH至4.5， 最后用水稀释到1L。 

5. 20%盐酸羟胺溶液。 

6. 对-甲苯磺酸溶液1.0 mol/L：准确称取17.2g对-甲苯磺酸，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀。 

7.乙酸铵缓冲溶液50 mmol/L：准确称取3.85g无水乙酸铵，置于1000mL容量瓶中，用冰乙酸调pH到4.5。

8.孔雀石绿标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿，用乙腈配制成100μg/mL的标准贮备液。准确吸取1mL 100μg/mL的标准储备液于100mL棕色容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，混匀，该标准溶液浓度为1μg/mL，于-18℃避光保存。

9.孔雀石绿标准工作液：准确吸取0.5mL 1μg/mL孔雀石绿标准溶液于25mL棕色容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，混匀，此标准工作液浓度为20ng/mL，于-18℃避光保存。 

四、操作步骤

1、样品制备

1.1提取

准确称取5.00 g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10 000 r/min的速度均质30秒，再加入10 mL乙腈剧烈震摇30 秒。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30 秒。以 3 000  r/min离心10 min。将上层清液转移至装有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL离心管中，并加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。

1.2净化 

在离心管中加入15 mL 二氯甲烷,振荡10 秒，3 000 r/min离心10 min， 将二氯甲烷层转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层，收集于100 mL梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1 mL，用2.5 mL乙腈溶解残渣。 

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到固相萃取柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5 mL，将洗涤液依次通过酸性氧化铝柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，准确加入0.5 mL乙腈溶解，过0.45μm 滤膜，滤液供液相色谱测定

2、高效液相色谱仪参考条件

色谱柱：C18 4.6 mm(i.d)×250mm，在C18色谱柱和检测器之间连接二氧化铅氧化柱；

流动相：乙腈+乙酸铵缓冲溶液(60+40)

流速：1 mL/min；

柱温：室温

波长：618 nm；

测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间按定性，外标峰面积法定量。

3、结果计算

试样中孔雀石绿的残留量按下式进行计算，计算结果需扣除空白值。

X=（C*A*V）/(W*A_s )

  式中：

 X——样品中孔雀石绿的残留量，单位为mg/kg；

C——孔雀石绿标准工作液的浓度，单位为ug/mL；

 A——样品中孔雀石绿的峰面积；

A_s——孔雀石绿标准工作液的峰面积；

V——样液最终定容体积，单位为毫升mL

W——最终样液所代表的试样量，单位为g；

   本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量的之和，以孔雀石绿表示

4、备注：

参考色谱图：

1. 10ng/mL孔雀石绿标准溶液

    

2. 20ng/mL孔雀石绿标准溶液